Obwohl vieles am Alterungsprozess noch rätselhaft ist, bleibt die Veränderung im Laufe der Zeit sein Kernmerkmal. Die biologischen Veränderungen, die mit dem Altern einhergehen, scheinen in vielen Zellen des Körpers aufzutreten. Das Problem ist, dass wir zig Milliarden Zellen haben und die Veränderungen in den meisten dieser Zellen – zum Teil aufgrund traditioneller technischer Beschränkungen – noch unbekannt sind.
Aus diesem Grund hat Junyue Cao von der Rockefeller University eine Reihe von Hochdurchsatz-Einzelzell-Genomanalysewerkzeugen entwickelt, mit denen untersucht werden kann, wie sich das Altern auf den molekularen Zustand von zig Millionen Zellen im Gehirn gleichzeitig auswirkt.
Das Labor für Einzelzellgenomik und Populationsdynamik von Cao hat nun zwei neue Werkzeuge und Konzepte zur Untersuchung der molekularen Veränderungen, der Genexpression und der interzellulären Dynamik des Alterns entwickelt. In Artikeln, die in Nature Neuroscience und Cell Genomics veröffentlicht wurden, beschreiben Cao und sein Team die beiden neuen Technologien sowie die bereits gewonnenen biologischen Erkenntnisse.
„Diese Ansätze verfolgen im Wesentlichen zwei unterschiedliche Wege, um verschiedene Elemente der zellulären Dynamik und die sich verändernden molekularen Prozesse, die mit dem Altern einhergehen, zu verstehen“, sagt Cao.
Molekulare Nachbarn
Das Labor von Cao ist auf die Entwicklung neuer Techniken der Hochdurchsatz-Einzelzellsequenzierung spezialisiert, die die genetische Expression und die molekulare Dynamik von Millionen einzelner Zellen gleichzeitig aufdecken.
Diese Methoden lassen sich zwar für verschiedene Analysen einsetzen, doch Caos Labor konzentriert sich auf das Altern. Sein Team hat bereits Einzelzellsequenzierung genutzt, um seltene Gehirnzelltypen zu identifizieren , den Alterungsprozess von Gehirnzellen zu verfolgen , die Zellen zu bestimmen, die am anfälligsten für altersbedingten Abbau sind, und um herauszufinden, dass das Altern ein Entwicklungsstadium sein könnte , das durch spezifische molekulare Signale ausgelöst wird.
Die beiden neuen Ansätze, die Caos Labor entwickelt hat, IRISeq und EnrichSci, gehen die zelluläre Alterung aus verschiedenen Blickwinkeln an.
IRISeq nutzt jüngste Erkenntnisse, die zeigen, dass DNA wie eine Art molekularer Barcode oder sogar ein Lineal fungieren kann und aufzeichnet, welche Moleküle nahe beieinander liegen, erklärt Abdulraouf Abdul, Doktorand in Caos Labor. „Jahrhundertelang haben Wissenschaftler Mikroskope verwendet, um Gewebe zu untersuchen und die Organisation von Zellen zu verstehen. Wir fragten uns: Könnte man DNA selbst nutzen, um ganze Gewebe zu kartieren, ganz ohne Mikroskop?“
Die Technik wurde genau für diesen Zweck entwickelt. Unter der Leitung von Abdul und Weirong Jiang, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter im Labor von Cao, entwickelte das Team ein optikfreies Hochdurchsatzverfahren, das Millionen von mit Barcodes versehenen, mikrometergroßen Kügelchen nutzt, um lokale Genexpressionsinformationen im Gewebe zu erfassen. Die Kügelchen tauschen DNA-basierte Signale mit benachbarten Kügelchen aus, wodurch die Forscher die Lage von Zellen im Gewebe bestimmen können – und das alles ohne Mikroskop. Abdul und seine Kollegen veröffentlichten die Ergebnisse in Nature Neuroscience .
„Mit IRISeq können wir die Gewebestruktur in verschiedenen Detailebenen rekonstruieren – fast wie beim Hinein- und Herauszoomen auf einer Landkarte –, ohne jemals ein einziges Foto aufzunehmen. Das bedeutet, dass wir sehr große Gewebestücke oder viele Gewebeschnitte untersuchen können, was mit herkömmlichen Bildgebungsverfahren deutlich schwieriger oder teurer wäre“, erklärt er. „Im Wesentlichen haben wir die Sequenzierung zu einer neuen Methode des ‚Sehens‘ biologischer Prozesse gemacht – und das zu einem Bruchteil der Kosten.“
Cao fügt hinzu: „Mithilfe dieser Karteninteraktion können wir beobachten, wie die Zellen während des Alterungsprozesses durch ihre externen Zellinteraktionen beeinflusst werden. Sie ermöglicht die Untersuchung der Interaktionen von praktisch zwei oder mehr beliebigen Zelltypen an beliebigen Stellen im Gehirn gleichzeitig.“
Mithilfe dieses Ansatzes kartierte das Team entzündliche Zellbereiche im alternden Gehirn. Sie fanden heraus, dass entzündliche Subtypen von Mikroglia, Oligodendrozyten und Astrozyten dazu neigen, sich in der weißen Substanz anzusammeln und miteinander zu interagieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die weiße Substanz eine besonders anfällige Region des alternden Gehirns sein könnte, in der krankheitsassoziierte Zellzustände entstehen und sich gegenseitig verstärken.
Sie fanden beispielsweise heraus, dass Immunzellen, sogenannte Lymphozyten, eine wichtige Rolle bei der Förderung von Entzündungen im alternden Gehirn auf eine ganz bestimmte Weise spielen.
„Ihre Aktivität konzentriert sich auf bestimmte Regionen, insbesondere in der Nähe der mit Flüssigkeit gefüllten Hohlräume des Gehirns, den sogenannten Ventrikeln“, sagt Abdul. „Ohne räumliche Informationen wäre diese Art von lokalisierter Immunaktivität leicht zu übersehen gewesen.“
„Die Kenntnis der Zelltypen, die sich zusammenballen, und der Orte, an denen sie dies tun, kann potenzielle Angriffspunkte für Anti-Aging-Maßnahmen liefern“, sagt Cao.
Veränderungen an unerwarteten Orten
Die zweite Methode, EnrichSci genannt und in Cell Genomics veröffentlicht , ist eine Einzelkern-RNA-Sequenzierungsmethode, die zunächst seltene, aber biologisch relevante Zellen in einer gemischten Zellpopulation gezielt identifiziert und isoliert, wodurch der Anteil des Zielzelltyps in der Probe erhöht wird. Nach der Anreicherung der seltenen Zielzellen analysiert EnrichSci anschließend detailliert die molekulare Programmierung jeder einzelnen Zelle.
Die Forscher nutzten EnrichSci im alternden Mäusehirn, um seltene Zellpopulationen anzureichern, die sie zuvor als besonders anfällig für problematische Veränderungen im Alterungsprozess identifiziert hatten. Darunter befanden sich Subtypen von Oligodendrozyten, die ausschließlich im zentralen Nervensystem vorkommen. Diese Zellen umhüllen neuronale Axone im Gehirn und Rückenmark und stehen in Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen. In diesen alternden Subtypen entdeckten die Forscher Veränderungen sowohl in der Genexpression als auch in einflussreichen genetischen Elementen, den sogenannten Exons, die für die posttranskriptionelle Regulation von Genen entscheidend sind.
„Exons sind die Teile von Genen, aus denen die reifen RNA-Transkripte bestehen, die entweder in Proteine ??übersetzt werden oder andere biologische Funktionen erfüllen“, erklärt Erstautor Andrew Liao, ein MD-Ph.D.-Student in Caos Labor.
Die von ihnen identifizierten exonischen Veränderungen zeigten, dass die posttranskriptionelle Regulation eine wichtige Rolle bei der Alterung von Oligodendrozyten spielt und neue Angriffspunkte für die Modulation dieser Veränderungen bei altersbedingter Neurodegeneration bieten könnte.
„Überraschenderweise stellten wir auch fest, dass viele Gene im Alterungsprozess keine signifikanten Expressionsveränderungen aufweisen, ihre Exons jedoch schon“, fügt Cao hinzu. „Diese Veränderungen hängen mit alternativem Spleißen zusammen, einem Schlüsselmechanismus zur Entstehung unterschiedlicher Proteinfunktionen. Solche Veränderungen können aber auch mit vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht werden.“
Jenseits des Alterns
Die Forscher hoffen, dass ihre Techniken sowohl als klinische als auch als Forschungsinstrumente zur Diagnose von Krankheiten und zur Aufdeckung neuer biologischer Zusammenhänge bei einer Vielzahl von Erkrankungen dienen können.
„Wir skalieren IRISeq bereits, um Alterungsprozesse und pharmakologische Interventionen in einem bisher unerreichten Umfang zu untersuchen. Kern dieser Vision ist die Erkenntnis, dass Zellen nicht isoliert agieren – ihr Verhalten hängt von ihrem Standort und den sie umgebenden Zellen ab“, erklärt Abdul. „Zellen ohne diesen Kontext zu untersuchen, ist, als würde man einzelne Wörter in einem Buch lesen, dessen Seiten auseinandergerissen wurden. Indem IRISeq die räumlichen Beziehungen zwischen den Zellen erhält, ermöglicht es die Untersuchung der Funktionsweise, der Veränderungen und der Krankheitsreaktionen von Geweben anhand größerer Proben und in breiteren Kontexten.“
Liao plant, EnrichSci so zu erweitern, dass es sowohl die RNA- als auch die Chromatinzugänglichkeit gemeinsam analysieren kann. „Ein solcher Co-Assay könnte Veränderungen der Gen- und Exonexpression sowie deren zugrundeliegende epigenetische Veränderungen erfassen“, erklärt er. „Wir hoffen, diese Methode anwenden zu können, um die altersbedingten Veränderungen in Oligodendrozyten und anderen vulnerablen Zelltypen bei altersbedingter Neurodegeneration weiter zu untersuchen.“
Cao erklärt, dass ihre neuen Techniken zur Untersuchung zellulärer Dynamiken in vielen biologischen Kontexten eingesetzt werden können. „Während sich mein Labor auf die mit dem Altern verbundene Zellpopulationsdynamik konzentriert, lassen sich diese Techniken für jedes Krankheitsmodellsystem anwenden. Beispielsweise kann IRISeq zur Untersuchung von Immunzellinteraktionen während der Krebsentwicklung genutzt werden, und EnrichSci kann posttranskriptionelle Veränderungen aufzeigen, die an der Krankheitsentwicklung beteiligt sein könnten.“
Zeitschrift
Nature Neuroscience
